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一、包涵體定義

包涵體是外源基因在原核細胞中表達時，尤其在大腸桿菌中高效表達時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時為高折射區(qū)，與胞質(zhì)中其他成分有明顯區(qū)別。它們致密地集聚在細胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（Inclusion Bodies，IB）。

一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1μm，具有很高的密度（約1.3mg/mL），無定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。包涵體形成是比較復(fù)雜的，與胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)生成速率有關(guān)，新生成的多肽濃度較高，無充足的時間進行折疊，從而形成非結(jié)晶、無定形的蛋白質(zhì)的聚集體；此外，包涵體的形成還被認為與宿主菌的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、溫度、pH值、離子強度等因素有關(guān)。細胞中的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)常以可融性或分子復(fù)合物的形式存在，功能性的蛋白質(zhì)總是折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)型。包涵體內(nèi)的蛋白是非折疊狀態(tài)的聚集體，不具有生物學(xué)活性。

圖1：包涵體

二、包涵體對于發(fā)酵制品的影響

包涵體具有富集目標蛋白質(zhì)、抗蛋白酶、對宿主毒性小等優(yōu)點。包涵體的形成對于重組蛋白的生產(chǎn)也提供了幾個優(yōu)勢：

(1)包涵體具有高密度，易于分離純化；

(2)組蛋白以包涵體的形式存在時可有效地抵御大腸桿菌中的蛋白酶對目的蛋白的降解；

(3)對于生產(chǎn)那些處于天然構(gòu)象時對宿主細胞有毒害的蛋白時，包涵體的形成無疑是不錯的選擇。

但是這些包涵體形式表達的蛋白通常是錯誤折疊的，因此不具備生物學(xué)活性，這將不利于發(fā)酵制品的應(yīng)用，同時也不利于蛋白的結(jié)構(gòu)分析以及蛋白組學(xué)的研究，所以大多數(shù)情況下都需要將不溶性的蛋白包涵體轉(zhuǎn)化為可溶性的蛋白。

三、包涵體的形成機理

(1)表達量過高：研究發(fā)現(xiàn)在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成的速率過快，以至于沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵錯誤配對，過多蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達到足夠的溶解度等。動力學(xué)模型表明：活性蛋白的產(chǎn)率取決于蛋白合成的速率、蛋白折疊的速率、蛋白聚集的速率(如圖1所示)。在高水平表達時, 新生肽鏈的聚集速率一旦超過蛋白正確折疊的速率就會導(dǎo)致包涵體的形成。

圖2：蛋白質(zhì)合成，折疊與聚集的示意圖

(2)異源蛋白無法糖基化：重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，真核糖蛋白無法糖基化使中間體溶解度下降，導(dǎo)致不溶解的包涵體形成。

(3)阻擾折疊：重組蛋白分泌序列存在阻礙折疊，導(dǎo)致錯誤折疊分子的產(chǎn)生。

(4)含硫氨基酸：重組蛋白的氨基酸組成，一般來說含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。

(5)中間體聚集：包涵體形成動力學(xué)研究表明，包涵體是由部分變性的中間體聚合而成。因此，任何影響中間體穩(wěn)定的因素，如pH值(pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體)離子強度和溫度都可以引起蛋白聚合反應(yīng)。

(6)化學(xué)鍵：在細菌分泌的某個階段，蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、疏水鍵或共價鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成。

(7)培養(yǎng)條件差：有報道認為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達，當培養(yǎng)條件不佳時，容易形成包涵體。

(8)缺乏相關(guān)折疊酶及其它因子：重組蛋白在大腸桿菌中表達時，缺乏一些蛋白折疊過程中需要的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等。

四、包涵體解決方案

4.1防止包涵體的形成

1、與分子伴侶共表達

分子伴侶是一類在序列上沒有相關(guān)性但有共同功能的蛋白質(zhì)，它們在細胞內(nèi)幫助其他含多肽的結(jié)構(gòu)完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與之分離，不構(gòu)成這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)執(zhí)行功能的組份。研究發(fā)現(xiàn)與分子伴侶共表達能有效的減少多肽鏈的錯誤折疊，提高蛋白的可溶性表達。該方式是利用基因工程技術(shù)將帶有分子伴侶基因片段的載體與帶有目的蛋白基因片段的載體共同轉(zhuǎn)入宿主細胞中，共同在宿主細胞中表達。

分子伴侶是一個相互作用、相互影響的有機整體，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶（Ero1）與分子伴侶二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）之間存在的相互作用，高慶華等學(xué)者通過單獨表達蛋白質(zhì)分子伴侶PDI和共表達PDI與Ero1，提高了重組葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的分泌表達。因此，在采用分子伴侶共表達的方式提高目的蛋白可溶性表達時應(yīng)該根據(jù)目的蛋白的結(jié)構(gòu)特征，選擇合適的分子伴侶來優(yōu)化表達組合。除此之外，還應(yīng)該考慮分子伴侶與啟動子、信號肽的組合以及發(fā)酵工藝條件等，進行條件優(yōu)化設(shè)計研究。寒梅等研究者將人內(nèi)皮他丁基因與GroEL-ES或DnaK-DnM-OrpE分子伴侶共表達，并在低溫（16℃）條件下培養(yǎng)，目的蛋白的可溶性表達量比單獨使用分子伴侶共表達的效果好。

目前，已經(jīng)在大腸桿菌中發(fā)掘了2大類分子伴侶，即熱休克蛋白Hsp60（包括GroEL和GroES）與熱休克蛋白DnaK、Hsp70、GrpE及DnaJ。不同的分子伴侶具備不同的性能，分子伴侶既能獨自起作用，也能協(xié)同發(fā)揮其作用。例如，GroEL（Hsp60伴侶蛋白家族）在可溶性和不可溶性蛋白質(zhì)組分之間運輸?shù)鞍踪|(zhì)，并積極參與解聚和包涵體的形成，DnaK（Hsp70伴侶蛋白家族）通過減少蛋白質(zhì)聚集并促進蛋白聚糖來阻止錯誤折疊的蛋白質(zhì)形成。另外，TaKaRa公司開發(fā)的5種分子伴侶組合可以確保幾個不同的分子伴侶一起參與新生多肽的折疊，從而協(xié)助那些大多以無活性包涵體方式表達的蛋白質(zhì)實現(xiàn)可溶性表達。此外，提高重組蛋白的可溶性表達還可以通過ClpB、GroEL-GroES和DnaK-DnaJ-GrpE伴侶系統(tǒng)及誘發(fā)因子的共同過度表達來實現(xiàn)。

2、基因改造

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（氨基酸序列）是影響包涵體形成的重要因素之一。替換目的蛋白中的某個或多個氨基酸，可有效抑制包涵體的形成，增加目的蛋白的可溶性表達。這可能是由于突變后目的蛋白的疏水性發(fā)生了改變或者是由于重組蛋白的穩(wěn)定性提高了。例如Jenkins T M等研究者將HIV-1整合酶的第185位苯丙氨酸突變成賴氨酸同時將第280位半胱氨酸突變成絲氨酸后，目的蛋白以可溶性的形式表達且整合酶的功能沒有受到影響，而在沒有進行定點突變并且其它條件完全一樣的情況下，重組蛋白則以包涵體的形式表達。但是定點突變也可能會對目的蛋白的活性造成影響，因此為了使目的蛋白的可溶性表達提高的同時其活性不受影響，對目的蛋白的基因改造需要結(jié)合目的蛋白的結(jié)構(gòu)以及活性特征。此外，研究者已經(jīng)開始根據(jù)計算機模擬的同源模型有針對性地對目的蛋白的突變進行設(shè)計，大大地提高了重組蛋白的可溶性和活性。

由于蛋白結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，目前結(jié)構(gòu)與功能完全清晰的蛋白依然較少，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能至今都還未知，這在一定程度上限制了蛋白質(zhì)的分子改造與設(shè)計的研究。因而定向進化的方法在蛋白質(zhì)性能改良中依然具有特定的位置。常用的定性進化的易錯PCR技術(shù)、化學(xué)誘變劑介導(dǎo)法、DNA改組等方法。易錯PCR技術(shù)是一種變換進行PCR時各組分的用量和使用保真度低的Taq DNA聚合酶，進而使DNA復(fù)制時保真度減少，新鏈合成時堿基錯配數(shù)增加，從而出現(xiàn)較多位點發(fā)生突變的擴增產(chǎn)物的一種DNA序列體外誘變的技術(shù)，是一種容易操作、有效的隨機突變策略?；瘜W(xué)誘變劑介導(dǎo)法是一種依據(jù)化學(xué)誘變劑處理連接了目的基因的載體之后從而產(chǎn)生隨機突變，然后使用限制性核酸內(nèi)切酶切割下已經(jīng)突變的基因片段，重新連接到表達質(zhì)粒之后轉(zhuǎn)化進宿主菌中進行篩選的方法。

3、融合表達

20世紀后期以來，融合標簽技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展為外源蛋白質(zhì)的可溶性表達帶來了福音。融合標簽不再局限于蛋白質(zhì)的提純與檢測，新融合標簽或能在蛋白折疊的過程中起作用，進而加強重組蛋白質(zhì)的可溶性表達，或能增加重組蛋白的表達量。大部分融合標簽是蛋白質(zhì)，只有小部分是多肽片段。

實驗探究結(jié)果顯示那些容易形成包涵體的重組蛋白融合某些高度可溶的蛋白后，可溶性表達量增加。這些蛋白質(zhì)主要包括麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，轉(zhuǎn)錄終止抗終止因子(NusA)，蛋白二硫鍵折疊異構(gòu)酶(DsbA)以及硫氧還蛋白A(TrxA)等。其中MBP與GST兩種融合標簽發(fā)展的較早，主要應(yīng)用于重組蛋白的親和層析。經(jīng)科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)，MBP與不溶性的蛋白質(zhì)融合后能加強外源蛋白的溶解性，但是融合標簽GST只能有限的增強外源蛋白質(zhì)的可溶性表達。科學(xué)家們的平行比較分析結(jié)果顯示，通常情況下，增強外源重組蛋白可溶性表達能力強的是MBP，NusA增強溶解性的能力與MBP相當，也有部分研究人員認為TrxA增強重組蛋白可溶性表達的能力也與之相當。此外，DsbA能在那些含有二硫鍵的蛋白質(zhì)之中發(fā)揮較好的作用。

目前，已經(jīng)提出了5種關(guān)于融合標簽提高重組蛋白可溶性表達機制的模型。

(1) “靜電屏蔽”模型：通過帶電蛋白質(zhì)之間的靜電斥力來減少乘客蛋白質(zhì)分子的聚集。此類標簽一般都具有強烈的負電荷，可直接參與幫助蛋白的正確折疊，例如Invitrogen公司研發(fā)的幾種超酸性融合蛋白（如rpoD和yjgD），由于其帶有很多負電荷，增大了新生肽鏈間的斥力，促使蛋白質(zhì)之間的空間距離變大，很難產(chǎn)生聚集，乘客蛋白質(zhì)也就有充足的時間進行準確折疊。

(2) “微囊體”模型：融合蛋白是通過細胞中產(chǎn)生的不完全折疊的由親水性載客蛋白質(zhì)包裹在外面，而疏水性蛋白質(zhì)作為中心的微囊體(micelle)而具有很好的溶解性。例如，人體乳頭瘤病毒E6與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)融合后形成微囊體模型結(jié)構(gòu)從而表現(xiàn)為可溶性蛋白質(zhì)。

(3) “熵錨”模型：載客蛋白質(zhì)作為一個錨定蛋白質(zhì)，使得折疊速度較慢的乘客蛋白質(zhì)的運動受到限制，進而不容易聚集，故而能讓乘客蛋白質(zhì)在合適的熵條件下折疊。該模型的分析結(jié)果表示，不管融合標簽在蛋白質(zhì)的C端還是N端，其產(chǎn)生的熵都應(yīng)該接近故增強蛋白質(zhì)溶解性也應(yīng)接近，可是研究發(fā)現(xiàn)融合標簽加在不同的末端，可溶性表達效果差異明顯。由此可以看出該模型并不能非常好的闡明蛋白質(zhì)溶解性增強的機理。

(4) “伴侶磁鐵”模型：同分子伴侶互相作用后的乘客蛋白質(zhì)可以引導(dǎo)分子伴侶協(xié)助乘客蛋白質(zhì)準確折疊。例如，鐵蛋白重鏈能引導(dǎo)分子伴侶DnaK來協(xié)助乘客蛋白質(zhì)折疊是由于其具有特定的序列，可以被DnaK識別并結(jié)合。

(5) “分子伴侶”模型：融合標簽充當分子伴侶，同乘客蛋白質(zhì)相互作用。據(jù)有關(guān)報道MBP就是一種可以充當分子伴侶的融合標簽。

4、改變培養(yǎng)基

研究表明培養(yǎng)基的組成對提高重組蛋白的可溶性表達有顯著的影響。首先培養(yǎng)基pH的穩(wěn)定對重組蛋白的可溶性表達有重要影響，研究時應(yīng)依據(jù)菌體與重組蛋白的特點來選擇合適的pH值。培養(yǎng)基的pH值離重組蛋白的等電點pI越遠，表達的目的蛋白就越不易形成包涵體。

圖2：工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計邏輯

其次，加入一些化學(xué)試劑也可能會提高重組蛋白的可溶性表達，例如一些TritonX-100、非代謝性糖類、乙醇等?？赡艿脑蚴且恍┓谴x性糖類，如蔗糖、山梨糖醇、甜菜堿、多元醇的存在會使培養(yǎng)基中的滲透壓增加，從而會導(dǎo)致細胞質(zhì)內(nèi)滲透壓防護劑積累，如甘氨?！卒@乙內(nèi)酯，能夠抑制細胞質(zhì)中的重組蛋白聚集，進而使得可溶性蛋白的表達水平提高。Black-well J R等研究者在培養(yǎng)基中添加了甜菜堿與山梨糖醇，使得可溶性的活性蛋白產(chǎn)量提高多達400倍。為了增加外膜的通透性，研究者在培養(yǎng)基中添加TritonX-100與甘氨酸。這兩種化學(xué)物質(zhì)都可以破壞細胞外膜的完整性，能夠改變細胞外膜的通透性，并且不會引起明顯的細菌裂解。例如唐金寶等研究人員在培養(yǎng)基中添加了終濃度為1％的Triton X-100和1％的甘氨酸，使得ProZZ-EGFP基因在培養(yǎng)基中的可溶性表達量提高6倍。

5、降低重組蛋白的合成速率

蛋白動力學(xué)模型的研究表明在高水平表達時，新生多肽鏈的聚集速度一旦超過了蛋白質(zhì)折疊的速度就會形成包涵體。因此可以通過降低重組蛋白的合成速率，使重組蛋白的可溶性表達提高。常用的方法包括選擇合適的啟動子、降低培養(yǎng)溫度、選擇合適的誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度以及使用較低濃度的誘導(dǎo)劑。

培養(yǎng)溫度降低有利于降低重組蛋白的合成速率，可能原因是在低溫條件下，細菌生長比較緩慢，目的蛋白的合成也就相應(yīng)較慢，新合成的蛋白能夠有更充足的時間進行折疊。同時培養(yǎng)溫度降低也可以降低重組蛋白的降解速率，從而使重組蛋白的穩(wěn)定性提高。Sim B J等研究人員將scIPNS基因在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達時，37℃條件下形成的是沒有活性的包涵體，而在28～25℃下獲得了可溶性表達，并且在25℃時起可溶性表達量較高，大約占總菌體量的29％。雖然培養(yǎng)溫度降低能提高外源蛋白可溶性表達，但是也會有一個下限，一般為8-10℃，因為培養(yǎng)溫度低于該溫度時，大腸桿菌就會停止生長，蛋白質(zhì)也就基本停止表達了。

誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)劑的用量也是控制可溶性外源蛋白表達的重要因素。誘導(dǎo)劑種類及其濃度都會對外源蛋白表達產(chǎn)生重要影響，應(yīng)根據(jù)所采用的表達系統(tǒng)(比如啟動子的強弱)和外源蛋白的特點優(yōu)化選擇。搖瓶培養(yǎng)時，應(yīng)選用低菌體濃度誘導(dǎo)，因為在低菌濃度下菌體處于對數(shù)生長期，生長活躍，有利于表達可溶性蛋白。然而，如果能保證合理的補料與充分的通氣，在較高菌濃度下誘導(dǎo)也同樣可能獲得可溶蛋白的高效表達。在某些情況下，誘導(dǎo)劑的流加能顯著提高可溶蛋白的表達水平。

6、選擇合適的表達系統(tǒng)

包涵體的發(fā)生很大原因取決于二硫鍵的形成和多肽是否正確折疊，因此可以選擇利于二硫鍵形成的宿主菌，例如Rosetta Origami(DE3), Origami(DE3)和Origami B(DE3)等。選擇合適的表達系統(tǒng)取決于重組蛋白的特性（例如重組蛋白的大小、二硫鍵的數(shù)目、目的蛋白的定位以及所需的翻譯后修飾的類型），重組蛋白的預(yù)期應(yīng)用（其應(yīng)用領(lǐng)域包括結(jié)構(gòu)研究、體內(nèi)研究、體外活性分析和作為抗原制備抗體）以及該系統(tǒng)能否生產(chǎn)足夠量的蛋白質(zhì)。

真核表達原核蛋白

—般來說，在選擇重組蛋白的表達宿主時，對來源于原核生物的蛋白來說，應(yīng)當只選擇大腸桿菌進行表達，而不是真核表達系統(tǒng)，這是由于真核生物的改善的折疊能力與翻譯后修飾能力對于原核蛋白來說是非必要的。

原核表達真核蛋白

而對于真核蛋白來說情況就不一樣了，因為有大量的實例表明，真核蛋白能在大腸桿菌中進行成功地表達。但是當使用原核系統(tǒng)表達真核蛋白時，需要考慮大腸桿菌對密碼子使用的偏性，一般通過密碼子優(yōu)化可以避免這個問題。在大多數(shù)情況下，如果重組序列是在親緣關(guān)系很遠的宿主中表達，也需要對密碼子偏性進行矯正。

4.2

包涵體的復(fù)性步驟

1、菌體的收集和破碎

提取的第一步是冷卻發(fā)酵液，由于包涵體比細胞可以耐受更大的剪切力，所以可以使用的破碎細胞的方法有很多。包涵體可以使用過濾或者離心的方法，把細胞破碎液中的其它成分除去用離心的手段可以把包涵體與細胞的其它成分分離開來。

2、包涵體的洗滌

包涵體在溶解之前需要進行洗滌，包涵體中主要含有重組蛋白，但也有一些雜質(zhì)，如一些外膜蛋白、質(zhì)粒DNA等，這些雜質(zhì)會與包涵體粘連在一起，可以通過洗滌去除大多數(shù)雜質(zhì)，但無法將雜蛋白去除干凈。包涵體的洗滌通常選用濃度較低的變性劑，如2M尿素在50mM Tris, pH7.0-8.5, 1mM EDTA中洗滌包涵體。此外可以用溫和的去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。同時，因為去垢劑的洗滌能力會隨溶液中的離子輕度升高而增強，所以在洗滌包涵體時可加入低濃度的尿素或高濃度的氯化鈉，使得包涵體的純度提高。具體操作可參考如下方式：沉淀用適量的包涵體洗滌緩沖液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）重懸后，攪拌洗滌20~30 min，于4℃，12000 rpm離心15 min，棄去上清液。重復(fù)2-3次。再用適量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗滌一遍（以去除殘留的EDTA），于4℃ 12000 rpm離心15 min，棄去上清液。

3、包涵體溶解

變性劑如尿素、鹽酸胍主要是通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽鏈延伸。鹽酸胍是較尿素強的變性劑，它能溶解尿素無法溶解的包涵體。兩種常用變性劑的比較如表1所示。SDS、正十六烷基三甲基氨氯化物、Sarkosyl等也可以破壞蛋白內(nèi)的二硫鍵，溶解一些蛋白質(zhì)。

另外，從某些含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)中分離出的包涵體，通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵，這就還需要加入還原劑，如巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）、半胱氨酸等。這種還原劑能同半胱氨酸形成各種二硫化物中間體，也會被復(fù)性用的二硫化物置換試劑所取代。二硫鍵的形成和斷裂是可逆的，直到有利的蛋白二硫鍵形成，這個平衡才會被打破。

表1：兩種常用變性劑的比較

如將沉淀用適量的包涵體溶解緩沖液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巰基乙醇，2％Triton）重懸，室溫攪拌5-6小時或過夜。12000 rpm 4℃離心15 min，收集上清液。

4、包涵體復(fù)性

復(fù)性是指通過去除變性劑使目標蛋白從完全伸展的變性狀態(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，，同時去除還原劑確保二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時復(fù)性開始，到2M左右時結(jié)束；而鹽酸胍可以從4M開始到1.5M時結(jié)束。復(fù)性的方法主要有透析復(fù)性，柱上復(fù)性和稀釋復(fù)性，三者的比較表2所示。